樣品實驗方案
簡要概述
1.準備細胞
2.去除生長培養基
3.添加Fluo-8 NW染料工作溶液
4.在室溫下孵育1小時
5.監測Ex / Em = 490 / 525nm處的熒光強度
溶液配制
1.儲存溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。 避免反復凍融循環。
1.1 Fluo-8 NW配制：
對于Cat No.36307，將10μLDMSO加入Fluo-8 NW（組分A）中，并充分混合。
對于Cat No.36308和36309，將100μLDMSO加入Fluo-8 NW（組分A）中，并充分混合。 注意：10μLFluo-8 NW原液足以容納1個平板。
1.2分析緩沖液儲備液（1X）：
對于Cat No.36307和36308，將9mL HHBS（組分C）加入10X Pluronic F127 Plus（1mL，組分B）中并充分混合。
對于Cat No.36309，將整瓶10XPluronic®F127Plus（10 mL，組分B）加入90 mL HHBS緩沖液（不包括在試劑盒中）中并充分混合。 注意：對于一個平板，10 mL的1X分析緩沖液就足夠了。
2.工作溶液配制
將10μLFluo-8 NW DMSO儲備溶液加入10mL 1X測定緩沖液中并充分混合。 該工作溶液在室溫下穩定至少2小時。
操作步驟
1.有關細胞樣品制備的指南，請點擊查看。
2.從細胞板上除去生長培養基。注意：重要的是去除生長培養基，以*大限度地減少背景熒光和化合物對血清或培養基的干擾。注意：或者，在含有0.5％至1％FBS的生長培養基中培養細胞，以避免培養基去除步驟。在這種情況下，需要在HHBS緩沖液中加入2X染料。 [我們為那些在生長培養基中使用0.5％至1％FBS以避免培養基去除步驟的人提供2個獨立的無洗滌鈣測定試劑盒（目錄號36315和目錄號36316）。
3.將100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Fluo-8NW染料工作溶液加入到細胞板中。
4.將染料加載板在細胞培養箱中孵育30分鐘，然后在室溫下將板孵育另外30分鐘。注意：如果測定需要37°C，立即進行實驗，無需進一步室溫孵育。注意：如果細胞在室溫下運行時間較長，可在室溫下孵育細胞培養板1-2小時（建議培養時間不超過2小時。）
5.用HHBS或所需緩沖液制備復合板。
6.通過監測Ex / Em = 490 / 525nm處的熒光強度來進行鈣通量測定。注意：在實驗之前運行信號測試很重要。不同的儀器有自己的強度范圍。將信號測試強度調整到*大強度計數的10％至15％的水平。例如，FLIPR-384的*大熒光強度計數為65,000，因此應調整儀器設置以使其信號測試強度在7,000到10,000左右。
數據分析
從空白標準孔獲得的讀數（RFU（Max-Min））用作陰性對照。 從其他標準的讀數中減去該值，以獲得基線校正值。 然后，繪制標準讀數以獲得標準曲線和方程。 該等式可用于計算卡巴膽堿劑量樣品。
圖1.使用Screen Quest Fluo-8 NW Assay Kit和Fluo-4 NW Assay Kit在HEK-293細胞中測量Carbachol劑量反應。 將HEK-293細胞以40,000個細胞/100μL/孔接種在Costar黑壁/透明底96孔板中過夜。 除去生長培養基，使用Screen Quest Fluo 8-NW鈣測定試劑盒或Fluo-4 NW試劑盒（根據制造商的說明書）將細胞與100μL染料上樣溶液一起在室溫下孵育1小時 溫度。 通過NOVOstar（BMG Labtech）添加卡巴膽堿（25μL/孔）以達到*終指示的濃度。 Fluo8 NW的EC50約為1.2μM。
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